用更快的肿瘤新抗原鉴定技术加速TCR-T免疫疗法的研发

近年来，相当多的急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）病人已经可以通过化疗和骨髓移植得到治疗，但治疗之后又复发的情况也时有发生，而这类复发的病人的预后普遍较差。因此，患者仍急需一种新的治疗方法，而免疫疗法则是目前为止最吸引人的一个。今天小编要介绍的论文就是从新抗原入手，研发了一种TCR-T的方法来治疗AML。

文章摘要

30%-35%的急性髓系白血病（AML）患者的nucleophosmin 1 (NPM1）基因都带有一种4bp的插入突变。该突变（ΔNPM1）会导致NPM1蛋白C端发生移框翻译，并产生一个新的长度为11个氨基酸的肽段。NPM1是AML中一个必要的驱动基因，因此这个新的肽段也被认为是治疗AML的理想靶点。通过免疫沉淀和质谱鉴定，研究人员从AML病人的临床样品中鉴定到了一个来自于ΔNPM1的肽段（CLAVEEVSL）。研究人员利用该肽段与HLA-A*02:01组合成的复合物从健康个体中成功鉴定到了与之对应的T细胞。其T细胞表面受体（TCR）进而被克隆，并表达在CD8+ T细胞中。这种经TCR转导的T细胞能够有效的识别并消灭含有ΔNPM1突变的肿瘤细胞，其抗肿瘤作用在免疫缺陷的小鼠中也得到了证实。总的来说，CLAVEEVSL是一个来源于ΔNPM1的新抗原，基于此设计的TCR-T具有治疗AML的广阔前景。

实验流程和结果

1.质谱鉴定新抗原

1）通过免疫沉淀富集得到AML中与HLA I结合的肽段，并进行质谱鉴定，最终鉴定到CLAVEEVSL，见下图A和B；

2）经验证CLAVEEVSL与HLA-A*02:01结合。

2.筛选对应的T细胞

1）合成带有肽段CLAVEEVSL的HLA-A*02:01的复合物，并利用它从健康个体中成功分离得到与之对应的CD8+ T细胞；

2)  经实验验证，其中1A2号T细胞能够高效的识别肽段CLAVEEVSL，而不识别对照组的肽段，见下图C。

3.制备TCR-T细胞

1)  1A2号T细胞的TCR被测序，并被表达在从健康个体中分离得到的T细胞中；

2）经实验验证，这些改造过的T细胞能够准确识别带有肽段CLAVEEVSL的抗原呈递细胞和含有ΔNPM1的AML肿瘤细胞，并释放IFN-γ。

4.在老鼠体内验证TCR-T的免疫疗效

用上述经过改造的T细胞治疗老鼠体内的AML肿瘤，效果显著，见下图D。

用更“快”的肿瘤新抗原质谱鉴定技术

才能更快地研发TCR-T免疫疗法

今天介绍的这篇文章利用质谱鉴定肿瘤新抗原，然后利用新抗原与HLA I组成的复合物顺利分离出与之对应的T细胞，经过基因测序找到TCR的序列，进而将其表达在T细胞的表面，这种经过改造的T细胞能够有效的识别并消灭AML肿瘤细胞。整个过程可以归纳为三个步骤：质谱鉴定；分离和鉴定T细胞；制备TCR-T并验证其活性（见上图）。在第一步“质谱鉴定”中，研究人员通过质谱共分析了12份AML病人的样品，最终鉴定到了5个候选肽段：VEEVSLRK，AVEEVSLR，CLAVEEVSL，AVEEVSLRK，CLAVEEVSLRK（见下图）。其中只有CLAVEEVSL可以结合HLA-A*02:01，而HLA-A*02:01在50%的白种人中都有表达，因此研究人员最终选定CLAVEEVSL作为靶点制备TCR-T细胞，并在老鼠体内验证了其抗肿瘤的活性。

这篇文章有两个细节值得我们关注：

1. 新抗原的发现离不开质谱鉴定技术

虽然NPM1基因序列上的突变早已探明，但是这11个氨基酸的突变肽段是否能被递呈到细胞膜表面仍是未知。本文通过质谱实验揭示了：1）该肽段确实能够被递呈，2）被递呈的肽段共有5种不同的形式。这个例子说明：只有质谱实验才能准确的，直接的鉴定到被递呈到细胞膜上的肽段序列，而基因组测序技术则无法提供这个数据。

2. 文中的质谱鉴定技术还不够高效

如下图所示，研究人员共分析了12份AML样品，但只有其中两份样品（AML10197，AML3361）能够鉴定到肽段CLAVEEVSL。而AML6395样品中则没有鉴定到任何来自于ΔNPM1的肽段（见下图红框）。同时，这12份样品通过质谱分析所得到的谱图数也有很大的波动（从524到12233不等）。因此我们有理由相信：一个更加稳定，更加高效的质谱鉴定技术平台将会给研究人员带来更多，更可信的新抗原序列。

我们上海快序生物科技有限公司目前推出了一套更“快”的肿瘤新抗原质谱鉴定技术服务。我们针对肿瘤新抗原的特征，优化了实验流程中的每一个细节，并将其整合成一套完整的操作流程。该服务能够帮助客户更“快”地鉴定肿瘤新抗原，进而加快TCR-T的研发进程。我们这项鉴定服务的优势如下：

1）更直接，我们不依赖于基因组测序结果，而是利用质谱鉴定技术对肽段进行测序；

2）更真实，我们不依赖于预测软件，而是直接从细胞中提取与MHC I结合的肽段，这样测得的数据更接近于细胞中真实的生理状态；

3）更多样，我们独有的肽段从头测序技术能够鉴定到多种不同来源的突变肽段；

4）更灵活，我们提供弱酸洗脱（MAE）和免疫沉淀（IP）两种肽段提取方案供客户选择。客户可以根据样品类型选择最优的肽段提取方式，以提高样品的利用率。

更多精彩推荐：

1. 更“快”的肿瘤新抗原的质谱鉴定技术概述

2. 如何才能更”快“的鉴定肿瘤新抗原？

3. 更“快”的肿瘤新抗原质谱鉴定技术, 加快双特异性抗体的研发