引言
本研究指出，抗体可变区与恒定区的搭配，分别或共同影响抗体的等电点、热稳定性、疏水性、粘度、溶解度等关键分子特性，最终影响抗体的可开发性。
基于质谱的从头测序技术，作为抗体开发的重要技术，可以通过获得抗体的全长氨基酸序列和存在的修饰，助力解析抗体的特性。Rapid Novor快序生物基于血清多抗蛋白的抗体开发技术，可以高效获得免疫动物血清中优质天然单抗的序列，这些经体内筛选的抗体，可变区与恒定区的适配程度更优，可开发性更高。
简介
在生物医药领域，单克隆抗体（mAbs）已成为对抗肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病及感染性疾病的核心治疗手段。尽管人类免疫球蛋白存在五种天然产生的类别(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，但迄今为止，研发阶段的重组治疗性抗体中绝大多数属于IgG类—— 在已上市的IgG抗体疗法中，约74%以IgG1为基础，IgG2和IgG4各占约13%。过去，IgG亚型的选择多聚焦于效应功能，却常常忽略了亚型差异对抗体“可开发性”的影响，其中一个核心原因在于，对IgG亚型如何影响抗体分子特性缺乏系统认识。由 Syndax Pharmaceuticals 与礼来（Lilly）研究团队联合完成的这项研究，揭示了 IgG 亚型对单抗分子特性的调控规律，为药物开发早期的亚型选择提供了关键实验依据。
一、抗体的构建与制备：排除干扰，聚焦亚型差异
抗体的可变区序列差异极大，因此想要分析不同IgG亚型对抗体特性的影响，需要排除可变区差异的干扰。为解决这一问题，研究团队构建了“固定可变区+可变亚型”的12种抗体（表1）。具体来说：
选择代表性可变区：先选择3个抗体可变区（Fv A、Fv B、Fv C），它们的电荷、疏水性差异显著，能覆盖临床中常见抗体的特性。比如Fv A带正电较多、疏水性低，Fv C疏水性则较强。
搭配 4 种核心亚型 / 变体：再将这3个可变区分别与4种常用的IgG亚型/变体（IgG1、IgG1EN、IgG2、IgG4PAA）的恒定区结合。其中，IgG1EN是IgG1的突变体，效应功能减弱；IgG4PAA是IgG4的突变体，能减少免疫反应，增强血清稳定性。
抗体制备与纯化：所有抗体都通过CHO细胞表达，并采用标准工艺纯化
表1 本研究使用的抗体
二、关键发现：IgG亚型对抗体特性的影响规律
研究团队从等电点、热稳定性、疏水性、粘度、溶解度等多个核心维度，系统分析了IgG亚型的作用，得出了一系列对抗体开发极具价值的结论。
1. 等电点（pI）：亚型微小影响，可变区主导
等电点是抗体制剂 pH 设计的核心依据 —— 若制剂 pH 接近抗体 pI，易引发分子聚集或沉淀。如表2所示，本研究发现：
亚型的影响：相同可变区下，pI排序为IgG1≈IgG1EN > IgG2 > IgG4PAA，差异幅度0.3-1.0单位。IgG1EN的5个突变仅让pI轻微降低0.1-0.2个单位，影响极小。
可变区的影响：可变区对pI的影响远大于亚型。Fv A的抗体pI最高（8.2-9.1），Fv C次之（6.3-7.4），Fv B最低（6.1-7.1），这和可变区的表面电荷分布直接相关 ——Fv A表面以正电为主，Fv B、Fv C则以负电为主。
计算与实测一致性：计算pI与实测pI的趋势一致，但实测值受三维结构影响（如氨基酸侧链暴露程度），存在与理论值存在一定差异。
表2 抗体的实测与计算等电点
2. 热稳定性：亚型影响 CH2 域，可变区决定 Fab 稳定性
热稳定性直接影响抗体的储存期限，通常用通过差示扫描量热法（DSC）检测解折叠温度（Tm）评估，Tm越低，抗体越容易在储存中降解，研究结果（图1）显示：
亚型的影响：相同可变区下，不同亚型解折叠起始温度（Tm-onset）约为60℃。Fab 域 Tm 方面，IgG1 mAbs 与 IgG1EN 相近，且高于或略高于 IgG2，同时高于 IgG4PAA 5。此外，IgG2 mAbs（尤其 IgG2-A）的热图谱更复杂，推测与不同的二硫键异构体构象有关。
可变区的影响：可变区对整体热稳定性影响更大。Fab Tm Fv A（80.3-86.0℃）> Fv B（76.0-77.2℃）≈ Fv C（76.4-77.7℃）。
图1 差示扫描量热法评估抗体的热稳定性
3. 疏水性：可变区主导，亚型影响可忽略
疏水性过强的抗体会在高浓度储存中发生聚集，导致药效下降或引发免疫反应。研究通过疏水相互作用色谱（HIC）检测保留时间及疏水相互作用潜力（HIP%），发现（表3）：
疏水性几乎完全由可变区决定：疏水性排序为 Fv C > Fv A ≈ Fv B，同源建模显示 Fv C CDR 域疏水性补丁最大，Fv A 最小。
亚型对疏水性的影响极小：同一可变区下，不同亚型的HIP%差异不到3%，仅IgG4PAA略高一点，但这种差异不足以引发聚集风险变化。这意味着，若想改善抗体的疏水性问题，优化可变区远比更换亚型更有效。
表3疏水相互作用色谱法评估抗体的疏水性
4. 粘度：亚型与可变区共同影响
高浓度制剂对粘度要求严苛，粘度过高会增加注射阻力，影响患者体验和药物吸收。研究发现，粘度是受“亚型-可变区”共同作用影响最显著的特性（表4）：
可变区的影响：粘度排序为Fv A（18.4-28.7 cP）> Fv B（9.1-13.4 cP）≈Fv C（9.4-14.9 cP）。
亚型的差异化影响：亚型对粘度的影响依赖于可变区特性（图3）：
o 搭配 Fv A/B 时：粘度排序为IgG4PAA > IgG1EN > IgG2 ≈ IgG1，推测与 IgG4PAA 的 CH3 域负电补丁增强 “Fv 正电 - Fc 负电” 相互作用有关；
o 搭配 Fv C 时：粘度排序为IgG2 > IgG4PAA ≈ IgG1EN ≈ IgG1，可能因 Fv C 的高疏水性掩盖了亚型电荷效应，而 IgG2 的二硫键异构体引发分子间交联，导致粘度升高。
特殊现象：IgG2-A 在高浓度储存中发生显著沉淀，无法检测粘度，提示部分IgG2抗体可能存在“高浓度稳定性缺陷”，需在早期开发中提前筛查。
表4 抗体的黏度
5. 溶解度：电荷状态是核心，亚型影响依赖 pI
溶解度是高浓度制剂的“准入门槛”，溶解度不足会导致抗体沉淀或产生浊度，影响药效和安全性。本研究采用“PEG诱导沉淀法”和“微浊度法”测试，结果高度一致（图4-5）：
可变区的主导作用：溶解度排序为Fv A > Fv C > Fv B，Fv A 因高 pI（电荷优势）溶解度最佳。
亚型的条件下影响：亚型对溶解度的调控依赖抗体整体 pI：在pH6.0的缓冲液中，当pI<7.5 时，排序为IgG1≈IgG1EN > IgG2 > IgG4PAA；pI>7.5（如Fv A）时，亚型差异消失（浊度低于检测下限）。
图4 通过PEG诱导沉淀法（a）和微量浊度法（b）评估抗体的溶解度
图5 抗体等电点与溶液微浊度的相关性
6. 结构解析：从分子层面验证规律
为解释实验现象，研究通过同源建模与表面特性分析，揭示了亚型与可变区调控分子特性的结构基础（图6）：
表面电荷分布：
可变区：Fv A 表面以正电为主；Fv B/C 则在 CDR 区存在显著负电簇；
恒定区：，净电荷排序为IgG1（16.1）> IgG1EN（14.7）> IgG2（12.3）> IgG4PAA（8.9），IgG4PAA CH3 域末端强负电补丁是其 pI 低、粘度高的关键。
疏水补丁分析：
可变区：Fv C 的 CDR 区疏水补丁面积最大，Fv A 最小，Fv B 为 “突出型疏水区域”，解释了疏水性检测中“Fv C > Fv B ≈Fv A”的规律。
恒定区：所有IgG亚型的恒定区疏水补丁大小与分布无显著差异，与HIC结果一致，进一步验证 “疏水性由可变区主导” 的结论。
图6 同源建模分析抗体表面电荷和疏水
三、实战指导：抗体开发如何选亚型？
这份研究的最大价值，在于将基础研究结论转化为可落地的开发策略，为抗体药物早期决策提供重要参考：
1. 优先选IgG1/IgG1EN：兼顾可开发性与灵活性
IgG1具有高溶解度、低粘度、良好热稳定性的综合优势，适合开发高浓度抗体；IgG1EN 能通过突变消除效应功能，避免“非靶免疫激活”，且保留了IgG1的可开发性优势，但需考虑控制CH2区的稳定性风险。
2. 慎用IgG4PAA：提前评估粘度与溶解度风险
IgG4PAA的使用需注意两点：一是若搭配 Fv A、Fv B 这类高正电可变区，容易因“Fv 正电-Fc 负电”相互作用导致高粘度；二是其低pI可能导致溶解度不足，可能在制剂方面需要多做优化。
3. 早期开展 “亚型 - 可变区” 组合筛查
鉴于亚型与可变区的“互动效应”（如Fv C 搭配IgG2 时粘度异常），应在早期筛选阶段就构建“同一 Fv + 多亚型” 的抗体库，同步pI（cIEF）、粘度（125 mg/mL）、溶解度（微浊度法）、热稳定性（DSC）等核心指标，找到治疗效应和可开发性间的平衡点。
结语
IgG 亚型的选择，看似是抗体开发早期的一个技术细节，却直接影响制剂开发难度、储存稳定性及临床给药方案的可行性。这份研究通过“固定可变区”的设计，揭示了 IgG 亚型的对抗体可开发性的关键调控作用，为抗体工程技术的发展、和更合优抗体药物的设计提供了重要指导。
参考文献
Tang, Y., Cain, P., Anguiano, V., Shih, J. J., Chai, Q., & Feng, Y. (2021). Impact of IgG subclass on molecular properties of monoclonal antibodies. mAbs, 13(1), 1993768. https://doi.org/10.1080/19420862.2021.1993768
